狗狗冠状病毒打几针？
犬冠状病毒（Canine coronavirus ，CCV）是一种感染犬科动物的冠状病毒科冠状病毒属病毒。这种病原可引发急性肠炎或急性胃肠炎症状，有时可引起严重腹泻，导致死亡[1]。该病在全世界范围内均有报道[2，3]，给动物养殖业、养犬业以及宠物商店和繁殖场带来了巨大的经济损失。根据病毒基因组序列分析结果将CCV分为两个亚型：CCV-A 和 CCV-B.其中前者流行于亚洲地区，后者以欧美国家为多发地[4]。中国分离到的CCV绝大多数为 CCV-B[5]。
本研究选择来自广东省不同地区的8株犬冠状病毒（4株CCV-B，两株分别来自广东中山和东莞；1株CCV-A; 1株未定型）进行全基因组测序和分析，旨在了解广东地区CCV的分子流行病学特征及其变异情况。
1 材料和方法
1.1 病料来源 本研究所用CCV病料均采自广东省各地的犬只粪便，采集地点包括广州、佛山顺德、河源、江门、湛江、潮州等地，所取粪便标本经广东省动物卫生监督所检疫，由临床医师确诊为犬患腹泻后采集。样品保存于-80℃冰箱中备用。
1.2 细胞培养与病毒感染 本研究中使用的细胞系为犬小肠上皮细胞 (CSUT7) 以及犬肾传代细胞系(DAK-KA1)[6，7]。 CSUT7 在含有 10% FBS 的 1640 基本培养基上生长。当细胞铺满 70～80 % 时，用含 2 % FBS 的培养基同步化细胞，之后接种病毒。
将病毒稀释到 1TCID50/ml， 以 0.1 ml/孔 接种至对数生长的 CSUT7 细胞， 37 °C 孵育 1 h， 再加入包含完全培养基的培养板内继续孵育。
1.3 DNA提取 从 100 μl 病料的匀浆液中提取病毒基因组 DNA，采用酚氯仿法，具体步骤参考生物化学与分子生物学实验技术手册[8]。DNA 浓度测定采用 NanoDrop ND-1000 UV－Vis Spectrophotometer，纯度及完整性采用分光光度计测定。
1.4 PCR扩增 PCR引物设计参考GenBank发表的冠状病毒(Marmotte， AY793720; Canis lupus familiaris coronavirus HKU5， EU899850 )的基因序列，并利用Primer Premier5.0软件设计一对引物P1： 5′ GAGTGGCTGTGGAACAAGCACTACC 3′， P2：5′ CTCAATTATCGTGTTGGTAGTAATG 3′， 预期产物大小为240 bp。PCR反应体系总体积为 50μl，包括： dNTP mixture (各 2m M)， 1× Buffer ， 2 m M MgCl2， 1 U Taq DNA Polymerase， 上游引物和下游引物（终浓度均为 0.8μM）以及 20 ng基因组 DNA。反应条件如下： 94°C预变性 5 min；94°C变性 30 s， 55°C退火 30 s， 72°C延伸 45 s，共 35个循环；最后 72°C延伸 10min。 每个处理设3个重复样。
1.5 克隆、鉴定与测序 PCRs产物回收纯化并经TA克隆载体转化大肠杆菌 Top 10 菌株，挑取单菌落进行PCR和双酶切鉴定。阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序。
1.6 全基因组拼接、基因结构分析使用DNASTAR Lasergene Suite v.7.1.5软件完成序列拼接与分析。通过GenBank收录的CCV基因组序列进行聚类分析和系统进化树构建，进化树构建方法为贝叶斯法。
1.7 突变检测 参照《分子流行病学实验指南》的相关内容[9]，采用 SSCP 多态性分析方法进行突变检测。
1.8 序列分析 使用 MEGA 5.05 对获得的序列进行分析：基因编码区序列比较使用 Kimura 二项式模型，遗传距离的计算使用 K2P模型；系统发育分析使用邻接法。
2 结果
2.1 PCR结果 经过 PCR 扩增，从 8 份犬粪便样本中得到了约为 240bp 的目的片段， 如图 1所示。
2.2 序列测定的结果和分析 将 PCR 扩增所得的目的蛋白片段克隆至 TA克隆载体重组质粒，挑选出阳性克隆，送上海生工生物科技有限公司测序。通过 GenBank 中登录的 CCV 毒株序列进行比对，发现此次所测得的 8 株序列均与CCV-B具有较高的同源性，而与 CCV-A亲缘关系较远， 因此初步判定此8株病毒均为 CCV-B变异株。
由于测序得到的序列长度较短且存在大量的 GC 富集区域，为了更加准确地对序列进行拼接和分析，我们选取了 Genbank 收录的 47 株 CCV 病毒的全基因组序列作为参考，借助 DNASIS Pro 软件进行了二次测序和拼接工作，最终获得完整的基因组序列并进行分析，部分序列比对结果参见表 2。
2.3 序列分析 根据 47 株 CCV B 型病毒的全基因组核苷酸序列，应用MEGA软件构建了系统发生树如图2所示， 所有毒株可以分为两大